Développement de méthode de purification des peptides en phase inverse

Introduction

La chromatographie en phase inverse est une technique très utilisée pour purifier les peptides. Cette technique doit sa popularité au fait que les temps de purification sont assez courts ainsi qu’aux efficacités atteintes. Les phases mobiles utilisées (principalement acétonitrile et eau) sont volatiles, ce qui facilite les étapes de concentration/lyophilisation.

Préparation de l’échantillon – Solubilité des peptides

La solubilité des peptides en solution dépend de plusieurs paramètres :

• la séquence en acides aminés (si des résidus hydrophobes sont présents, cela diminue la solubilité en milieu aqueux)
• la taille et la structure tertiaire des peptides. La solubilisation change, en fonction de la répartition des résidus
• pourcentage en résidus chargés (il faudra appliquer des pH particuliers pour aider la solubilisation).

Il existe quelques règles à connaître pour la solubilisation en milieu aqueux :

• Les peptides constitués de moins de 5 résidus sont généralement solubles, sauf si les résidus sont hydrophobes (Tryptophane, Isoleucine, Leucine, Phénylalanine, Méthionine, Valine ou Alanine).
• Les peptides hydrophiles contenant plus de 25% de résidus chargés (Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine et Histidine) et moins de 25% de résidus hydrophobes sont généralement dissous dans un milieu aqueux, à condition que les résidus chargés soient distribués dans toute la séquence
• Les peptides hydrophobes contenant de 50% à 75% de résidus hydrophobes peuvent êtres insolubles ou partiellement solubles dans des solutions aqueuses, même s’ils contiennent 25% de résidus chargés (généralement, ils sont solubles dans le TFA et l’acide formique)
• Les peptides acides (residus Acide glutamique et Acide asparagique) et basiques (residus Arginine, Lysine, Histidine) sont plus solubles à pH neutre qu’à pH acide.
• Les peptides très hydrophobes qui ont plus de 75% de résidus hydrophobes ne se dissolvent pas dans des solutions aqueuses. Il est préférable de faire un dépôt solide pour convenablement injecter ces peptides.
• Les séquences peptidiques comportant une très grande proportion en Sérine, Thréonine, Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine, Histidine, Asparagine, Glutamine ou Tyrosine peuvent former un réseau de liaisons hydrogènes intermoléculaires et ont une tendance à former des gels en solution aqueuse quand ils sont concentrés. Ces peptides peuvent être traités comme des peptides hydrophobes.

Bien entendu, avant de passer l’échantillon sur la colonne, il est préférable de tester la solubilité d’une petite partie dans les conditions de début de méthode. Dans le choix des solvants, préférez un solvant facilement retirable par lyophilisation pour récupérer les solutés le plus pur possible.

Comment sont élués les peptides ?

Les interactions qui régissent les purifications de peptides en phase inverse sont entre la phase stationnaire et le squelette hydrophobe du peptide. Elles sont non dispersives et peu sélectives avec 2 mécanismes principaux qui sont de l’adsorption et du partage.

Les petits peptides (avec des masses molaires inférieures à 3kDa) sont élués par un mécanisme de partage tandis que les peptides plus gros sont élués principalement par un mécanisme d’adsorption. Cela revient à dire que les molécules à l’injection se « collent » contre la phase stationnaire, puis éluent dès que la proportion en solvant organique atteint un pourcentage défini.

Rétention en fonction de la fraction volumique d’acétonitrile

Choix de la phase stationnaire

Le choix de phase stationnaire dépend de la longueur des chaines peptidiques des solutés qui peut limiter les interactions par gêne stérique.

On utilisera de préférence une colonne C18 pour des peptides de tailles petites et moyennes, puis une colonne C8 pour des peptides plus importants et C4 pour des polypeptides.

Le second paramètre à prendre en compte est la porosité de la phase à employer. En effet, plus le peptide sera long, plus il sera difficile de le faire passer dans un pore de petite taille. Les peptides de 1 à 5kDa se sépareront avec une taille de pore de 100Å, ceux entre 5 et 20 kDa pourront être séparés avec une taille de pore de 200Å, et les polypeptides seront utilisés avec une taille de pore de 300Å.

Le dernier point concerne la taille des particules. Etant donnée la difficulté de certaines purifications, il n’est pas intéressant d’utiliser des tailles supérieures à 30µm.

Choix des conditions de solvants

Les solvants les plus utilisés sont l’eau et l’acétonitrile. L’acétonitrile permet d’augmenter l’élution des peptides. Le fait que ce solvant ne réponde pas trop en UV et soit facilement retirable, en fait un choix tout indiqué.

Il est courant d’utiliser en même temps de l’acide trifluoroacétique (TFA) comme agent d’appariement d’ion (cela permet de réduire les interactions ioniques entre les peptides et la phase stationnaire). La  forte volatilité du TFA en fait un bon élément car facilement retirable (attention toutefois à ce qu’il soit présent en même proportion dans les deux solvants). Son inconvénient est qu’il rendra difficile la détection MS. Il faut alors, soit baisser sa concentration (mais on dégrade le profil), soit utiliser un autre agent comme de l’acide formique par exemple qui permet la détection.

Pour des applications avec des composés très hydrophobes, il est possible d’utiliser de l’isopropanol, solvant avec un pouvoir éluant plus important. Il présente l’avantage, non négligeable, de garder l’activé biologique des peptides. Ce solvant est principalement utilisé pour des polypeptides sur colonne C4, 300Å.

Généralement on commence la méthode avec 5% de solvant fort pour augmenter la force éluante de 1%/min, ce qui permet d’obtenir de bonnes résolutions.
Pour des applications avec des peptides polaires, il faut utiliser un mode HILIC, en démarrant avec 95% d’acétonitrile pour tendre vers 85%.

Influence des paramètres

Plusieurs paramètres peuvent permettre d’optimiser les purifications :

• Gradient : Comme expliqué dans la partie mécanisme, les peptides (>3kDa) sont élués par un mécanisme d’adsorption. Un gradient par palier pour l’élution peut s’avérer utile.
• Réactif d’appariement d’ion. Le TFA est le plus utilisé mais il est possible d’utiliser du FA, PFPA, HFBA (agent anionique) ainsi que du TEA, TBA (agent cationique) qui pourront alors aider à la séparation de peptides possédant des résidus Basiques.
• Température : la température de la colonne est un critère d’optimisation. Il permet de diminuer la viscosité du solvant (permettant une baisse significative de la contre-pression) tout en permettant de diminuer le temps de sortie des produits. Attention toutefois à ne pas dégrader les solutés avec une température trop élevée.
• Débit : Si pour les petites molécules, le débit est un critère d’optimisation permettant de gagner du temps avec une petite perte de résolution, c’est le contraire pour les peptides plus importants : une augmentation du débit entrainera une dégradation du profil de la purification.

Pour les peptides de faible masse molaire, il existe un débit optimal
(courbe de Van Deemter….)
Pour les peptides de masse molaire élevée, l’augmentation du débit altère le profil des pics. Cela peut même provoquer des dédoublements de pic si le débit est trop élevé.
Tyrosine : 181 g/mol
Myoglobin : 17 000 g/mol
Albumin : >60 000 g/mol

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